1、穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞株的定義及特點
穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞株，也稱為穩(wěn)定細胞株，指的是通過基因工程手段獲得的持續(xù)穩(wěn)定過表達或者干擾特定基因的細胞株。穩(wěn)定轉(zhuǎn)染（又稱穩(wěn)轉(zhuǎn)）旨在將外來DNA整合到宿主基因組中以便于永久改變細胞的遺傳組成。穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞株的主要優(yōu)勢在于它能夠在較長的時間內(nèi)維持基因表達的一致性?；谶@個優(yōu)勢，穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞株應(yīng)用范圍廣（比如重組蛋白和抗體生產(chǎn)、基因編輯、功能性研究）且經(jīng)穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞株生產(chǎn)的生物制品批間差小。
2、穩(wěn)定轉(zhuǎn)染與瞬時轉(zhuǎn)染的區(qū)別
與穩(wěn)定轉(zhuǎn)染相對應(yīng)的是瞬時轉(zhuǎn)染，什么是瞬時轉(zhuǎn)染？顧名思義，指將外來遺傳物質(zhì)（通常是DNA或RNA）暫時引入宿主細胞，進行短期表達，而不會永久整合到細胞基因組中。
Figure 1. Schematic diagrams of two different transfections [1]
除了外源基因是否整合到宿主細胞這個區(qū)別外，穩(wěn)定轉(zhuǎn)染可實現(xiàn)外源基因的持續(xù)表達，而且需要構(gòu)建細胞系；構(gòu)建一個穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞株耗時6至12個月是常態(tài)；可適用于持續(xù)進行且具有穩(wěn)定改變的研究。與穩(wěn)定轉(zhuǎn)染不同，瞬時轉(zhuǎn)染中外源基因表達的時間短，通常只有幾天，而且無需建立細胞系，耗時短且方便；不過只適用于只需進行臨時基因改造即可進行的實驗。盡管穩(wěn)定轉(zhuǎn)染有諸多優(yōu)點，但在選擇是用穩(wěn)定轉(zhuǎn)染還是瞬時轉(zhuǎn)染時，主要依據(jù)還是取決于研究目標的具體要求。
選用穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的情況通常有以下幾種：
- 需要長期和持續(xù)基因表達或持續(xù)蛋白質(zhì)生產(chǎn)的研究，穩(wěn)定轉(zhuǎn)染通常是首選途徑。因為通過構(gòu)建穩(wěn)定株，可以大大降低頻繁轉(zhuǎn)染或者病毒包裝的成本，這也極大方便實驗研究；
- 部分蛋白半衰期極長，瞬時RNA只能干擾表達，卻無法去除已表達的目的蛋白，這種情況通過構(gòu)建穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞株可以實現(xiàn)更好的基因干擾效果；
- 需要用誘導表達系統(tǒng)的，主要是一些致死基因或者是需要時空表達的；
- 若是需要用細胞做動物實驗的，比如裸鼠成瘤等，往往需要構(gòu)建成穩(wěn)轉(zhuǎn)株。
選擇瞬時轉(zhuǎn)染的情況有：
- 短期實驗或需要快速產(chǎn)生蛋白質(zhì)且不需要持久的基因改變的情況。因為這種方法靈活且快速，可最大限度地降低意外基因組整合的風險，且無需建立穩(wěn)定的細胞系。
- 針對于那些開發(fā)合適的穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞株存在困難的項目，瞬時轉(zhuǎn)染通常也是臨床試驗中大規(guī)模批量生產(chǎn)慢病毒載體的首選方法。
那目前常用于構(gòu)建穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞株的方法又有哪些？
3、構(gòu)建穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞株的方法
目前穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞系的構(gòu)建方法主要包括慢病毒介導、轉(zhuǎn)座子介導、CRISPR敲入及質(zhì)粒篩選四種方法。其中，質(zhì)粒篩選是最原始的細胞系構(gòu)建方案，操作上只需要把目的質(zhì)粒成功轉(zhuǎn)染到細胞內(nèi)，然后使用對應(yīng)抗性長期篩選，有一定的概率獲得穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞株，但效率低且不穩(wěn)定，盡管成本低，但已不是首選。由于慢病毒幾乎可以感染所有類型的細胞，并且可以將遺傳物質(zhì)整合到宿主細胞基因組中，進行長時間的穩(wěn)定表達，而且介導效率高，所以慢病毒介導方法是當前穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞株構(gòu)建的主流方法。
4、慢病毒介導穩(wěn)賺細胞株構(gòu)建過程
慢病毒介導的穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞株構(gòu)建主要分為三大步：慢病毒表達載體構(gòu)建、慢病毒包裝及穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞株構(gòu)建。
Figure 2. Stable Cell Lines generation by lentivirus
慢病毒表達載體構(gòu)建主要是將外源基因構(gòu)建到慢病毒載體中生成重組慢病毒載體，這通常涉及目的基因的確定及表達載體的選擇。關(guān)于表達載體的選擇，這個需要根據(jù)自己的實驗?zāi)康倪M行選擇。通常可根據(jù)載體抗性、啟動子類型、可溶和表達熒光蛋白、是否需要篩選穩(wěn)轉(zhuǎn)株等選擇合適的載體。
慢病毒包裝主要是指將重組慢病毒載體與包裝質(zhì)粒（如rev、gag/pol、vsv-g等）共轉(zhuǎn)染到宿主細胞中，用來產(chǎn)生具有感染能力的慢病毒顆粒。為了能高效感染目的細胞，在這步，我們通常會對病毒進行濃縮及滴度測定。關(guān)于病毒濃縮，通常是在轉(zhuǎn)染后48-72小時后收集含有病毒顆粒的培養(yǎng)基，通過超速離心沉淀法、PEG8000濃縮法等方法進行濃縮，以提高病毒滴度。
穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞株構(gòu)建這一環(huán)節(jié)包括病毒感染靶細胞、篩選穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞、單克隆培養(yǎng)、擴增與鑒定及功能研究。其中，最重要的是病毒感染靶細胞和篩選穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞。病毒感染靶細胞是指將上一步中濃縮的病毒顆粒與靶細胞共培養(yǎng)，使病毒整合到宿主細胞基因組中，感染效率可通過觀察綠色熒光蛋白（GFP）等報告基因的表達來評估。注意，在病毒感染靶細胞時，由于慢病毒對不同種屬、不同組織來源細胞的感染性差別很大，需要針對不同類型的細胞計算感染復(fù)數(shù)（MOI），即感染時病毒和細胞數(shù)量的比值。篩選穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞通常是在病毒感染靶細胞后，通過抗生素篩選（如嘌呤霉素、新霉素等）或其他篩選標記，篩選出穩(wěn)定表達外源基因的細胞克隆。
5、穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞株在抗體藥物發(fā)現(xiàn)中的應(yīng)用
如前所述，穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞株的主要特點是將目標基因整合到其基因組中，從而實現(xiàn)持續(xù)表達，生產(chǎn)的生物制品批間差小?；谶@個優(yōu)勢，穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞株可廣泛應(yīng)用于藥物發(fā)現(xiàn)的多個階段，包括靶點識別與驗證、篩選與檢測開發(fā)和重組蛋白抗體生產(chǎn)。在靶點識別與驗證階段，穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞株通過在受控環(huán)境中穩(wěn)定表達靶點蛋白，可用于識別和驗證潛在藥物靶點；在篩選與檢測開發(fā)階段，穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞株可用于識別潛在藥物候選分子，并開發(fā)可靠的檢測方法以測試藥物的有效性；在重組蛋白抗體生產(chǎn)階段，利用穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞株，可確保蛋白抗體生產(chǎn)的一致性和高效性，而且穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞株也適合大規(guī)模生產(chǎn)。由于穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞株都是哺乳動物細胞，可對生產(chǎn)的重組蛋白抗體進行必要的修飾，模擬人類特有的糖基化修飾，這對治療效果至關(guān)重要。目前，已有多家生物制藥公司利用穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞株生產(chǎn)單克隆抗體，如曲妥珠單抗（Herceptin）和利妥昔單抗（Rituxan），這些藥物被廣泛用于治療疾病。
除了抗藥物發(fā)現(xiàn)，穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞株在CAR-T細胞療法發(fā)展進程中也功不可沒。通過生產(chǎn)嵌合抗原受體（CAR），這些CAR被工程化導入T細胞，增強其對癌細胞的靶向和殺傷能力。
6、締碼130+現(xiàn)貨穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞株，助力藥物研發(fā)
締碼生物是一家專注于可成藥靶點臨床前研發(fā)產(chǎn)品和服務(wù)的生物技術(shù)公司。締碼最近推出了130+新型穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞株，這些細胞株能夠在常用的細胞系（如K562、293T、CHO-S和Jurkat等）中穩(wěn)定表達藥物靶點蛋白（如GPRC5D、B7H4、CLDN6、Trop2和PD-L1等）。這些新研究工具為藥物發(fā)現(xiàn)提供了強大的支持，能夠加速靶點驗證、抗體篩選及其他藥物開發(fā)流程。通過使用我們的穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞株，研究人員可以大幅提高實驗的一致性和生產(chǎn)效率，幫助推動新藥的快速開發(fā)。
- 部分細胞株驗證數(shù)據(jù)
- 穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞株熱門現(xiàn)貨靶點
參考文獻：
[1] Kim, T. K., & Eberwine, J. H. (2010). Mammalian cell transfection: the present and the future. Analytical and bioanalytical chemistry, 397(8), 3173–3178.
