體外功能分析平臺

平臺介紹

締碼生物依托武漢生物技術研究院實驗平臺，擁有高速細胞分選儀、分析型流式細胞儀、3D活細胞共聚焦系統(tǒng)、熒光倒置顯微鏡、全功能微孔板分析儀等儀器設備，可滿足相關腫瘤靶點抗體分子藥效功能評價的各種實驗需求。同時，締碼生物針對腫瘤靶點抗體分子，建立了一整套完善的體外評價體系。

系統(tǒng)的體外功能分析

締碼生物從腫瘤靶點抗體分子的臨床應用出發(fā)，建立了系統(tǒng)的體外功能分析測試平臺，包括細胞增殖抑制測試、細胞毒性測試、CDC測試、ADCC測試、ADCP測試、炎癥因子測試等，全方位的評價候選腫瘤靶點抗體分子的功能，助力藥企客戶候選抗體分子的發(fā)現(xiàn)和應用。

表1.體外功能分析檢測項目

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部分體外功能測試介紹

1.基于流式的細胞結合力分析

對于早期篩選的多個抗體分子，通過分析這些抗體分子和其靶點在天然細胞上的結合力，以便客戶進行評估分級，決定最佳抗體分子。圖1展示了利用流式測試抗體分子的結合力。

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圖1.結合力分析

2. 阻斷活性分析

如果希望開發(fā)阻斷天然配體和受體相互作用而達到治療效果的抗體分子，我們會在篩選階段將相應的配體受體阻斷實驗設計進去，能夠快速的獲得具有阻斷功能的抗體分子。圖2展示了SIRPα抗體分子阻斷CD47蛋白與THP-1細胞上SIRPα蛋白的結合，其阻斷活性IC50為30.88ng/ml。

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圖2.阻斷活性分析

3.生物發(fā)光檢測系統(tǒng)

利用螢火蟲熒光素酶報告基因系統(tǒng)(Luciferase Based reporter Gene System)特異性標記的靶點腫瘤細胞，不僅可用于體外免疫細胞殺傷評價，還可以直接用于活體動物水平的腫瘤免疫模型評價。我們利用多發(fā)性骨髓瘤細胞系NCI-H929構建的熒光素酶報告基因系統(tǒng)，測試了BCMA雙特異性抗體（DM2克隆）的體外殺傷效果，見圖3。

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圖3.基于熒光素酶腫瘤殺傷分析

4. 補體依賴的細胞毒性(CDC)測試

諸如CD20單抗、CD52單抗等抗體分子與靶細胞表面的分子結合后，可以介導補體C1q結合到抗體的Fc部分，并與腫瘤細胞膜上形成類似于穿孔素效應的攻膜復合體（MAC)，造成細胞外離子大量內流，最終導致腫瘤細胞的溶解（如圖4示意圖）。

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圖4.CDC作用機制示意圖

5. 抗體依賴性細胞介導的細胞毒性（ADCC)測試

抗體通過與靶細胞表面抗原特異性結合，招募如NK細胞等效應細胞殺死靶細胞。NK細胞表面表達FcγRIIIa蛋白，是一種抗體Fc區(qū)域的受體，能識別并結合抗體的Fc端，從而使NK細胞結合到靶細胞周圍。一旦Fc受體與抗體的Fc區(qū)域結合，在NK細胞中Fc受體(FcR)活化，尤其是FcRγIIIa受體(CD16)活化能夠引起NFAT(nuclear factor of activated T-cells)信號通路的激活，NK細胞就會釋放細胞因子和細胞毒性顆粒，進入靶細胞觸發(fā)細胞凋亡（如圖5示意圖）。

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圖5.ADCC作用機制示意圖

6. CAR T-細胞構建及功能測試

抗體制備平臺的一個突出的優(yōu)勢是我們可以快速獲得抗體的基因序列，對于諸如CAR T-細胞的應用，可以在早期先導分子篩選階段就將抗體的scFv序列構建到CAR結構中，通過測試CAR T-細胞的腫瘤殺傷能力，讓客戶在抗體早期功能篩選時做出判斷，圖6展示我們CAR T-細胞測試的流程。

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圖6.CAR T-細胞功能測試流程