抗體偶聯(lián)藥物（Antibody-drug conjugates，ADC）主要由單克隆抗體、連接子和細(xì)胞毒素（又稱為有效載荷或Payload）三部分構(gòu)成。其中抗體作為ADC藥物的“導(dǎo)彈”，具有靶向功能，可以特異性識(shí)別腫瘤細(xì)胞表面抗原，與細(xì)胞表面抗原結(jié)合后發(fā)生內(nèi)吞，將細(xì)胞毒素帶到腫瘤細(xì)胞并發(fā)揮毒性效應(yīng)。由于一些抗體與抗原結(jié)合后不一定會(huì)被靶細(xì)胞內(nèi)吞，所以抗體內(nèi)化能力是ADC藥物早期篩選的一項(xiàng)重要指標(biāo)。那抗體內(nèi)化的原理是什么？作用途徑有哪些？影響抗體內(nèi)化的因素又有哪些？目前抗體內(nèi)化的檢測(cè)方法又有哪些呢？
1、抗體內(nèi)化原理及途徑
如前所述，抗體內(nèi)化，也可以理解為抗體內(nèi)吞，是指在細(xì)胞表面的抗體與相應(yīng)的抗原結(jié)合后，通過自身分子運(yùn)輸體系，將抗體和抗原復(fù)合物帶入細(xì)胞內(nèi)部，并在內(nèi)部起到特定的生物學(xué)作用?？贵w內(nèi)化是大多數(shù)ADC藥物分子進(jìn)入細(xì)胞的方式。常規(guī)內(nèi)吞作用可分為三個(gè)階段：芽形成；膜彎曲和囊泡成熟；以及膜分裂并釋放到細(xì)胞質(zhì)中。通過對(duì)當(dāng)前已上市ADC藥物內(nèi)化方式的分析（如下圖所示），ADC藥物內(nèi)化途徑可根據(jù)是否依賴網(wǎng)格蛋白分為兩類：一是網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞作用（CME）；二是網(wǎng)格蛋白非依賴性內(nèi)吞作用。其中，網(wǎng)格蛋白非依賴性內(nèi)吞作用會(huì)進(jìn)一步分為小窩蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞作用、小窩蛋白非依賴性載體蛋白/GPI錨定蛋白富集的早期內(nèi)體區(qū)室 (CLIC/GEEC) 和巨胞飲作用。
Figure 1. collection of endocytosis pathways utilized by the target antigens for the currently approved ADCs [1]
這里我們重點(diǎn)介紹一下ADC藥物內(nèi)吞的主要途徑-網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞作用。網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞作用包括一些連續(xù)且部分重疊的步驟。不同受體的CME觸發(fā)機(jī)制并不一樣。CME可以由質(zhì)膜上的某些受體組成型啟動(dòng)，也可以通過受體與配體和/或抗體結(jié)合來啟動(dòng)。當(dāng)細(xì)胞質(zhì)里的內(nèi)吞衣殼蛋白開始在質(zhì)膜內(nèi)小葉上聚集時(shí)，CME就開始了。衣殼蛋白通過從細(xì)胞質(zhì)中募集額外的接頭蛋白并與其相互作用來繼續(xù)組裝和生長。關(guān)鍵的銜接蛋白使膜彎曲，從而將內(nèi)化受體/配體聚集到“網(wǎng)格蛋白包被坑”（CCP）中。由于CCP內(nèi)陷變大，CCP頸部會(huì)收縮，繼而通過一個(gè)斷裂過程與質(zhì)膜分離。肌動(dòng)蛋白聚合有助于將CCP“向內(nèi)”拉入細(xì)胞質(zhì)，直到分裂完成，CCP被釋放并成為網(wǎng)格蛋白包被的囊泡（CCV）。最后，CCV外殼被分解，CCV 與內(nèi)體融合并分選到特定的亞細(xì)胞位或循環(huán)回到細(xì)胞表面 [1]。
Figure 2. The mechanism of Clathrin-mediated endocytosis
2、影響抗體內(nèi)化的因素有哪些
抗體是否能被內(nèi)化主要由靶點(diǎn)決定，而抗體內(nèi)化的效率受到多方面因素的影響，主要因素包括抗體的親和力和特異性、抗體的類型和亞型、抗體的劑量和濃度及細(xì)胞的類型和狀態(tài)。
抗體的親和力和特異性：親和力高的抗體能更有效地與抗原結(jié)合，促進(jìn)內(nèi)化。特異性高的抗體能更精確地識(shí)別抗原，避免非特異性結(jié)合。
抗體的類型和亞型：不同類型和亞型的抗體有不同的受體和信號(hào)通路，影響內(nèi)化的速度和效率。例如，IgG和IgA的內(nèi)化速度較快，而IgM和IgE的內(nèi)化速度較慢。
抗體的劑量和濃度：抗體的劑量和濃度越高，與抗原的結(jié)合越多，內(nèi)化的可能性越大。但是，過高的抗體劑量和濃度也可能導(dǎo)致受體飽和或下調(diào)，降低內(nèi)化的效果。
細(xì)胞的類型和狀態(tài)：不同類型的細(xì)胞有不同的受體表達(dá)和內(nèi)化能力，影響抗體內(nèi)化的差異。細(xì)胞的狀態(tài)也會(huì)影響內(nèi)化的動(dòng)力學(xué)，例如，活化的細(xì)胞內(nèi)化速度較快，而凋亡的細(xì)胞內(nèi)化速度較慢。
此外，分子量較大的抗原通常更難被細(xì)胞內(nèi)化，而且，哪怕同一靶點(diǎn)的不同抗體也會(huì)表現(xiàn)出不同的內(nèi)化效率。所以，在ADC藥物研發(fā)過程中，篩選出高內(nèi)化效率的抗體是安全性的重要保證。
3、如何檢測(cè)抗體內(nèi)化
有多種常規(guī)方法用于抗體檢測(cè)內(nèi)化。根據(jù)檢測(cè)實(shí)驗(yàn)類型可分為四大類，包括基于活細(xì)胞成像的內(nèi)化檢測(cè)、基于毒素偶聯(lián)的殺傷檢測(cè)、基于pH探針的內(nèi)化檢測(cè)和基于溫度轉(zhuǎn)變的熒光二抗內(nèi)化檢測(cè)。
基于活細(xì)胞成像的內(nèi)化檢測(cè)也稱為Incucyte，是通過實(shí)時(shí)活細(xì)胞成像儀對(duì)裸抗進(jìn)行藥效動(dòng)力學(xué)的實(shí)時(shí)檢測(cè)。不同于終點(diǎn)檢測(cè)，它是多濃度點(diǎn)、多時(shí)間點(diǎn)模式抗體內(nèi)化檢測(cè)的最佳選擇?？蓪?duì)活細(xì)胞實(shí)時(shí)觀察，連續(xù)檢測(cè)可長達(dá)72小時(shí)。
基于毒素偶聯(lián)的殺傷檢測(cè)主要包括兩種方法，一種是DT3C法，一種是Mab-ZAP方法。二者都是通過抗體-毒素復(fù)合物在細(xì)胞內(nèi)釋放毒素然后引發(fā)細(xì)胞毒性。然后通過檢測(cè)細(xì)胞殺傷來評(píng)估抗體的內(nèi)化效果。DT3C是2014年MikiYamaguchi等人通過基因重組技術(shù)生產(chǎn)的一種重組蛋白，由一個(gè)沒有受體結(jié)合域的白喉毒素(DT)和鏈球菌蛋白G的C1、C2、C3 (3C)結(jié)構(gòu)域組成。Mab-ZAP由小鼠抗體和核糖體失活蛋白皂草素組成。與傳統(tǒng)的Mab-ZAP方法相比，DT3C法中mAb-DT3C偶聯(lián)物分子量更穩(wěn)定，內(nèi)化效率更高，適用性更廣，成本更低。
基于PH探針的內(nèi)化檢測(cè)和基于溫度轉(zhuǎn)變的熒光二抗內(nèi)化檢測(cè)是兩種常用的檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)化過程的方法，它們都有各自的優(yōu)缺點(diǎn)。基于PH探針的內(nèi)化檢測(cè)是利用熒光探針對(duì)pH值的敏感性，來反映細(xì)胞內(nèi)囊泡的酸化程度，從而判斷內(nèi)化的進(jìn)程和位置?；跍囟绒D(zhuǎn)變的熒光二抗內(nèi)化檢測(cè)是利用熒光二抗在不同溫度下的熒光強(qiáng)度變化，來區(qū)分細(xì)胞內(nèi)外的熒光信號(hào)，從而判斷內(nèi)化的效率和程度。兩種方法的優(yōu)缺點(diǎn)如下：
| 基于PH探針的內(nèi)化檢測(cè) | 基于溫度轉(zhuǎn)變的熒光二抗內(nèi)化檢測(cè) | |
| 優(yōu)點(diǎn) | 方法簡(jiǎn)便，操作方便，無需復(fù)雜的儀器和試劑； 熒光信號(hào)清晰，可定量分析，適用于高通量篩選； 可用于多種細(xì)胞類型和多種熒光標(biāo)記物，如抗體、配體、藥物等。 | |
| 缺點(diǎn) | 需要選擇合適的pH敏感探針，以匹配不同的內(nèi)化通路和目標(biāo)； 不同的pH探針有不同的pH響應(yīng)范圍和靈敏度，也有不同的熒光性質(zhì)和穩(wěn)定性； pH探針可能會(huì)受到其他因素的干擾，如細(xì)胞內(nèi)其他熒光物質(zhì)、細(xì)胞內(nèi)外的緩沖系統(tǒng)等。 | 需要控制好溫度的變化，以保證熒光信號(hào)的可靠性； 不同的熒光二抗有不同的溫度敏感性，也有不同的熒光性質(zhì)和穩(wěn)定性； 溫度轉(zhuǎn)變可能會(huì)影響細(xì)胞的生理狀態(tài)和內(nèi)化的動(dòng)力學(xué)，也可能會(huì)影響熒光標(biāo)記物的結(jié)合和釋放等。 |
4、締碼pH敏感試劑助力抗體內(nèi)化檢測(cè)
由締碼研發(fā)的DiTag PH敏感IgG標(biāo)記試劑提供了一種易于測(cè)試抗體內(nèi)吞的解決方案。這兩款試劑（AME100001和AME100002）利用PH敏感熒光標(biāo)記的Fc結(jié)合蛋白與來自不同物種的IgG抗體結(jié)合，導(dǎo)致熒光標(biāo)記抗體-試劑復(fù)合物的形成?？贵w內(nèi)吞后，周圍PH變?yōu)樗嵝裕贵w和標(biāo)記試劑復(fù)合物的熒光信號(hào)明顯增強(qiáng)。熒光強(qiáng)度的強(qiáng)弱可以直接反應(yīng)抗體內(nèi)吞的效率。通過測(cè)量熒光信號(hào)強(qiáng)度，研究人員可以評(píng)估抗體內(nèi)吞效率。兩款產(chǎn)品的主要區(qū)別在于特異性標(biāo)記的IgG亞型，如下表所示：
| AME100001 | AME100002 | |
| specific IgG types | Human IgG1, IgG2, and IgG4 Rabbit IgG Mouse IgG2a and IgG2b | Human IgG1, IgG2, IgG3, and IgG4 Rabbit IgG Mouse IgG1, IgG2a, IgG2b, and IgG3 |
·DiTagTM pH sensitive IgG labeling reagent (AME100001)
Figure 3. The fluorescent signal from GPRC5D ADC BMK-AME100001 conjugate is only detected in GPRC5D positive cells (K562-GPRC5D stable expression cell line), indicating specific internalization.
Figure 4. Stability test of AME100001. Three storage methods are tested: lyophilization and reconstitution (black), liquid with 50% glycerol at -20℃ (red), liquid at 4℃ (blue). All three methods exhibit excellent stability.
·DiTagTM pH sensitive IgG labeling reagent plus (AME100002)
Figure 5. The fluorescent signal from GPRC5D ADC BMK-AME100002 conjugate is only detected in GPRC5D positive cells (K562-GPRC5D stable expression cell line), indicating specific internalization.
參考文獻(xiàn)：
[1] Hammood M, Craig AW, Leyton JV. Impact of Endocytosis Mechanisms for the Receptors Targeted by the Currently Approved Antibody-Drug Conjugates (ADCs)-A Necessity for Future ADC Research and Development. Pharmaceuticals (Basel). 2021 Jul 15;14(7):674.
