抗體藥物因其特異性高，治療效果顯著，具有優(yōu)越的藥代動(dòng)力學(xué)等特性，在生物藥市場(chǎng)中舉足輕重。根據(jù)Frost & Sullivan的統(tǒng)計(jì)預(yù)測(cè)，到2030年全球抗體藥物市場(chǎng)規(guī)模預(yù)計(jì)增至4,431億美元。隨著抗體藥的需求逐步擴(kuò)大，抗體發(fā)現(xiàn)及篩選技術(shù)的發(fā)展勢(shì)在必行。目前抗體技術(shù)應(yīng)用較普遍的有雜交瘤技術(shù)、噬菌體展示技術(shù)和B細(xì)胞克隆技術(shù)。技術(shù)各有千秋，本期我們重點(diǎn)聊聊單B細(xì)胞抗體技術(shù)。
1、什么是單B細(xì)胞抗體技術(shù)？
單B細(xì)胞抗體技術(shù)是指利用一個(gè)B細(xì)胞只含有一個(gè)功能性重鏈可變區(qū)DNA序列和一個(gè)輕鏈可變區(qū)DNA序列，以及一個(gè)B細(xì)胞只產(chǎn)生一種特異性抗體的特性，從免疫動(dòng)物組織或外周血中分離特異性B細(xì)胞，然后再通過(guò)單細(xì)胞PCR技術(shù)從分泌單個(gè)抗體的B細(xì)胞中擴(kuò)增重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)DNA序列，最后在哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)表達(dá)獲得具有生物活性的單克隆抗體。目前，單B細(xì)胞抗體技術(shù)已廣泛應(yīng)用于病原微生物感染、腫瘤、自身免疫性疾病和器官移植等方面，并顯示出了獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)和良好的應(yīng)用前景。
2、單B細(xì)胞抗體技術(shù)的優(yōu)勢(shì)有哪些？
傳統(tǒng)的雜交瘤技術(shù)抗體，開(kāi)發(fā)周期長(zhǎng)，包括免疫通常要8個(gè)月左右。而且受雜交瘤融合率的限制，整個(gè)B細(xì)胞群中只有一小部分B細(xì)胞完全融合，獲得的陽(yáng)性克隆少，不適合用于大型抗體庫(kù)進(jìn)行全面篩選。對(duì)于噬菌體展示技術(shù)而言，盡管其庫(kù)容量很大，但是其重鏈可變區(qū)（VH）和輕鏈可變區(qū)（VL）的配對(duì)通常依賴于隨機(jī)組合，形成的大部分都是非自然的VH-VL抗體配對(duì)。而單B細(xì)胞抗體技術(shù)，作為繼雜交瘤技術(shù)與噬菌體展示技術(shù)之后的新一代抗體開(kāi)發(fā)技術(shù)，擁有開(kāi)發(fā)周期長(zhǎng)、陽(yáng)性克隆多、全人源、需要的細(xì)胞量少等優(yōu)勢(shì)。最重要的是，通過(guò)單B細(xì)胞抗體技術(shù)獲得的抗體能確保輕鏈和重鏈天然配對(duì)，這在抗體開(kāi)發(fā)是至關(guān)重要的。
3、單B細(xì)胞抗體技術(shù)的流程是什么？
單B細(xì)胞抗體技術(shù)整個(gè)流程主要有五步，包括B細(xì)胞富集、單個(gè)B細(xì)胞篩選、抗體基因測(cè)序與分析、重組抗體表達(dá)和抗體功能驗(yàn)證。
Figure 1. the process of single B cell antibody technology
B細(xì)胞富集，B細(xì)胞一般來(lái)源于外周血，可以通過(guò)靜脈采血后離心分離白細(xì)胞層來(lái)獲得B細(xì)胞。
單個(gè)B細(xì)胞篩選，也稱為單個(gè)B細(xì)胞分離或陽(yáng)性克隆篩選，指的是從混合的B細(xì)胞群體中分離出單個(gè)B細(xì)胞，是單B細(xì)胞技術(shù)中最關(guān)鍵的步驟。根據(jù)樣本類型的不同，單個(gè)B細(xì)胞分離可以分為隨機(jī)分離和抗原特異性分離。隨機(jī)分離是指只需要分離B細(xì)胞，常用的分離方法有顯微操作、激光捕獲顯微切、熒光激活細(xì)胞分選法。這類分離適用于抗原特異性抗體濃度高的樣本（例如來(lái)源于疫苗接種者或患者的血樣）?？乖禺愋苑蛛x指需分離抗原特異性B細(xì)胞，常用的分離方式包括熒光標(biāo)記抗原多參數(shù)細(xì)胞分、抗原標(biāo)記磁珠分選法、微雕法、以及細(xì)胞微陣列芯片。這類分離適合抗腫瘤抗體、自身免疫抗體等特異性抗體含量較低的情況。
在獲得單個(gè)B細(xì)胞后，需對(duì)其抗體基因進(jìn)行測(cè)序及分析。如前所述，這一步可以通過(guò)單細(xì)胞PCR技術(shù)擴(kuò)增重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)DNA序列，然后進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序完成后可通過(guò)生物信息學(xué)對(duì)測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，包括基因序列比對(duì)、突變鑒定和親和力評(píng)估等。
通過(guò)上一步的抗體基因測(cè)序與分析，通常會(huì)選擇親和力較好的抗體基因進(jìn)行重組抗體表達(dá)。具體如何選擇需要根據(jù)自己的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)來(lái)。在生物藥研究領(lǐng)域，常用于重組抗體表達(dá)的表達(dá)系統(tǒng)為哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)。
抗體基因重組表達(dá)后，需要進(jìn)一步對(duì)其功能進(jìn)行驗(yàn)證，確定其生物活性及抗原結(jié)合能力，常用的驗(yàn)證方法包括流式細(xì)胞術(shù)、酶聯(lián)免疫吸附和免疫組化等。
4、締碼基于單B細(xì)胞技術(shù)的兔單抗發(fā)現(xiàn)平臺(tái)
締碼生物基于單B細(xì)胞技術(shù)的創(chuàng)新型兔單抗發(fā)現(xiàn)平臺(tái)，其創(chuàng)新點(diǎn)主要集中在克隆抗體基因之前對(duì)單個(gè)B細(xì)胞進(jìn)行體外培養(yǎng)。與傳統(tǒng)的使用單細(xì)胞PCR技術(shù)相比，締碼克隆的數(shù)百個(gè)B細(xì)胞的抗體基因來(lái)自于單個(gè)親本B細(xì)胞。這種方法顯著提高了克隆的成功率，使締碼能夠從免疫動(dòng)物中獲得更多的陽(yáng)性先導(dǎo)抗體序列。通常情況下，一只兔子的B細(xì)胞總數(shù)可達(dá)3-5×10^8個(gè)，從中可獲得的分泌特異性抗體B細(xì)胞克隆總數(shù)可達(dá)上萬(wàn)個(gè)。該平臺(tái)利用兔單抗的優(yōu)勢(shì)，可提供從抗原合成到抗體功能驗(yàn)證的一站式服務(wù)，時(shí)間周期短，可直接獲取抗體基因序列和功能蛋白抗原。
平臺(tái)流程
Figure 2. 締碼單B細(xì)胞兔單抗發(fā)現(xiàn)流程
案例展示
BCMA-先導(dǎo)抗體分子開(kāi)發(fā)及CAR-T應(yīng)用
GPRC5D先導(dǎo)抗體分子開(kāi)發(fā)及CAR-T應(yīng)用
此外，針對(duì)熱門藥物靶點(diǎn)，締碼還制備了B細(xì)胞種子庫(kù)。締碼單克隆抗體B細(xì)胞種子庫(kù)是由接受免疫的兔子中分離的B細(xì)胞構(gòu)建而成，這些B細(xì)胞已經(jīng)預(yù)先通過(guò)ELISA和FACS驗(yàn)證，可以特異性結(jié)合抗原蛋白。締碼單克隆抗體B細(xì)胞庫(kù)主要用于篩選先導(dǎo)抗體分子。篩選出的先導(dǎo)分子有著多樣的CDR序列和良好的可成藥性。目前有相應(yīng)種子庫(kù)的靶點(diǎn)，最快35天獲得先導(dǎo)抗體。截止到2023年底，近5年的時(shí)間，締碼完成407個(gè)新靶點(diǎn)B細(xì)胞種子庫(kù)的制備，275個(gè)藥物靶點(diǎn)先導(dǎo)抗體分子開(kāi)發(fā)。除了兔單抗，締碼還搭建了鼠單抗、羊單抗和納米抗體開(kāi)發(fā)平臺(tái)，歡迎合作垂詢。
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