1. 關(guān)于Synthetic Nanodisc
傳統(tǒng)的MSP納米盤中的脂質(zhì)成分可能與天然細(xì)胞膜的脂質(zhì)成分不同，導(dǎo)致膜蛋白的某些特性與原生膜環(huán)境下有所偏差，因此有一定的局限性。締碼研發(fā)的Synthetic Nanodisc，能直接從完整的細(xì)胞中制作，該平臺利用具有疏水和親水雙重特性的物質(zhì)作為穩(wěn)定劑，穩(wěn)定劑朝向內(nèi)部脂層的疏水面可將膜蛋白整合到Nanodisc中，維持膜蛋白的天然空間構(gòu)象和活性。同時(shí)，朝外的親水面使得Nanodisc在水溶液中具有很高的溶解度和穩(wěn)定性。在這個(gè)過程中，使用合成高分子具有雙重功能。首先，它溶解細(xì)胞膜，類似于洗滌劑，同時(shí)利用天然細(xì)胞磷脂在膜蛋白周圍形成納米盤結(jié)構(gòu)。此外，締碼使用哺乳動物表達(dá)系統(tǒng)來制備膜蛋白，這可確保蛋白在結(jié)構(gòu)、功能和翻譯后修飾方面與天然對應(yīng)物非常相似，使其成為生物化學(xué)和生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域廣泛應(yīng)用的理想工具。接下來我們以近期較火熱的GPCR靶點(diǎn)GPR75為例子，講述Synthetic Nanodisc這一技術(shù)是如何幫助我們更有效地表達(dá)和純化GPCR蛋白。
Left: MSP Nanodisc; Right: Synthetic Nanodisc)
2. 關(guān)于GPR75
2.1 GPR75結(jié)構(gòu)
GPR75又稱為G蛋白偶聯(lián)受體75，是G蛋白偶聯(lián)受體家族（GPCR）中的一員，屬A類GPCR。GPCR是細(xì)胞表面受體中最大的家族，負(fù)責(zé)細(xì)胞識別各種外部刺激，包括激素，神經(jīng)遞質(zhì)，脂質(zhì)等。這個(gè)家族的受體均有7個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域（TM1-7），由三個(gè)細(xì)胞外環(huán)（ECL1-3）和三個(gè)細(xì)胞內(nèi)環(huán)（ICL1-3）連接。其中第三細(xì)胞內(nèi)環(huán)（ICL3）的結(jié)構(gòu)非常靈活，長度變化很大。ICL3可與G蛋白相互作用，而G蛋白是細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)所必須的。有研究發(fā)現(xiàn)ICL3在結(jié)晶的GPCR中是無序的，因此為了提高GPCR結(jié)晶的穩(wěn)定性，ICL3通常被可溶性蛋白質(zhì)替代。
(Structural Simulation of GPR75 Protein)
2.2 GPR75與生物醫(yī)藥開發(fā)
研究表明GPR75在肥胖、癌癥和代謝綜合征等許多疾病中發(fā)揮重要作用。迄今為止，已檢測到GPR75的三種配體，包括20-HETE、CCL5和RANTES。有研究發(fā)現(xiàn)20-HETE 通過 GPR75 觸發(fā)包括 PI3K/Akt 和 RAS/MAPK 在內(nèi)的信號通路，導(dǎo)致前列腺癌細(xì)胞更具侵襲性表型。此外，PI3K/Akt 和 RAS/MAPK 信號通路激活 NF-κB，這在癌癥發(fā)展的各種通路（例如增殖、遷移和凋亡）中具有重要意義。研究結(jié)果表明，抑制人類 GPR75 會導(dǎo)致胰島素敏感性和葡萄糖耐量增加，以及體內(nèi)脂肪儲存減少。根據(jù)這些發(fā)現(xiàn)，GPR75可能成為肥胖、代謝綜合征和癌癥等疾病藥物治療的潛在靶點(diǎn)。
但是像GPCR這種典型的膜蛋白，其特有的疏水性的螺旋結(jié)構(gòu)嵌入細(xì)胞膜中，使得GPCR在水溶液中不穩(wěn)定，且在大多數(shù)表達(dá)系統(tǒng)中，GPCR的表達(dá)量較低。此外，GPCR的構(gòu)象不穩(wěn)定，會根據(jù)其配體的結(jié)合狀態(tài)發(fā)生變化，在純化過程中，不同的構(gòu)象會影響結(jié)合親和力。基于其膜蛋白的特性、低表達(dá)量、構(gòu)象變化等多方面因素給研究者們在純化蛋白時(shí)帶來諸多挑戰(zhàn)，締碼開發(fā)了多種解決方案以助力研究者們更加快速便捷的獲取高純度，高穩(wěn)定性的具有天然構(gòu)象的膜蛋白。下面讓我們一起了解下這些解決方案。
3. GPR75-Nanoodisc多種解決方案
3.1 Flag標(biāo)簽
Flag標(biāo)簽是一種短的、常見的肽序列（通常為DYKDDDDK），可以通過Anti-Flag抗體進(jìn)行高效的免疫捕獲。其在蛋白表達(dá)和純化中具有以下優(yōu)勢：
增強(qiáng)純化的特異性：由于抗Flag抗體具有較高的親和力，能夠特異性地與標(biāo)簽結(jié)合，從而減少非特異性結(jié)合的雜質(zhì)。
對蛋白功能的干擾較?。?/strong>Flag標(biāo)簽相對較小，不容易影響膜蛋白的結(jié)構(gòu)和功能，尤其是在跨膜蛋白的純化過程中，膜蛋白的結(jié)構(gòu)與功能通常比較敏感。
純化效率高：Flag標(biāo)簽可以通過專門的抗體（如Anti-Flag抗體）進(jìn)行親和純化，整個(gè)過程比較簡單。這對于跨膜蛋白，特別是對于那些在膜中非常穩(wěn)定的蛋白，能夠提供一個(gè)高效、穩(wěn)定的純化手段。
廣泛應(yīng)用于多種表達(dá)系統(tǒng)：Flag標(biāo)簽可以在大腸桿菌、酵母、昆蟲細(xì)胞和哺乳動物細(xì)胞等系統(tǒng)中表達(dá)。無論在什么系統(tǒng)中表達(dá)的膜蛋白，F(xiàn)lag標(biāo)簽都可以有效地與抗體結(jié)合，從而實(shí)現(xiàn)純化。
高靈敏度的檢測：由于Flag標(biāo)簽的高度特異性，使用抗Flag抗體可以對表達(dá)的膜蛋白進(jìn)行。即使是低表達(dá)量的膜蛋白也能通過抗Flag抗體進(jìn)行有效的檢測和富集。
基于上述優(yōu)勢，F(xiàn)lag標(biāo)簽也成為膜蛋白純化的常用標(biāo)簽。
Human GPR75 full length protein-synthetic nanodisc (Cat# FLP100031)
Left: Elisa plates were pre-coated with Flag Tag GPR75-Nanodisc and anti-GPR75 monoclonal antibody (DMC100368); Right: WB analysis of Human GPR75-Nanodisc with anti-Flag monoclonal antibody.
3.2 MBP標(biāo)簽
MBP（Maltose Binding Protein，麥芽糖結(jié)合蛋白）標(biāo)簽是一種常用的融合標(biāo)簽，廣泛應(yīng)用于膜蛋白的表達(dá)和純化過程中。其在蛋白表達(dá)和純化中具有以下優(yōu)勢：
提高溶解性：由于膜蛋白的疏水性和結(jié)構(gòu)復(fù)雜性，，容易形成包涵體，而MBP通過提供一個(gè)疏水性較低的外部結(jié)構(gòu)，可以促進(jìn)膜蛋白在溶液中的穩(wěn)定性，減少包涵體的形成。
增強(qiáng)表達(dá)量：MBP標(biāo)簽?zāi)軌蚋纳颇繕?biāo)膜蛋白的折疊和溶解性，因此能顯著提高目標(biāo)蛋白的表達(dá)量。很多膜蛋白在沒有標(biāo)簽的情況下表達(dá)量較低，而與MBP融合后，可以在大腸桿菌等表達(dá)系統(tǒng)中得到高水平的表達(dá)。
簡化純化過程：MBP標(biāo)簽可用于親和層析純化。在純化過程中，MBP與麥芽糖親和結(jié)合，可以使用含麥芽糖的樹脂輕松地純化融合蛋白。這一純化過程簡便，且具有較高的純度。此外，通過MBP標(biāo)簽的特異性結(jié)合，能夠有效地去除大多數(shù)雜蛋白。
可去除性：MBP標(biāo)簽可以通過特定的酶切去除，常用的酶包括胰蛋白酶和His標(biāo)簽蛋白酶。這為下游實(shí)驗(yàn)提供了更純凈的目標(biāo)蛋白，尤其是當(dāng)膜蛋白的功能和結(jié)構(gòu)與標(biāo)簽干擾時(shí)，去除MBP標(biāo)簽后能夠恢復(fù)目標(biāo)蛋白的生物學(xué)活性。
穩(wěn)定性和折疊支持：MBP標(biāo)簽?zāi)軌蛟谀承┣闆r下幫助膜蛋白正確折疊，從而保持蛋白的功能和結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性，防止在純化過程中蛋白降解或失活。這對于結(jié)構(gòu)解析（如X射線晶體學(xué)或冷凍電鏡）以及功能研究至關(guān)重要。
Human MBP-GPR75 full length protein-synthetic nanodisc (Cat# FLP110031)
Left: Human MBP-GPR75-Nanodisc with N-MBP Tag, C-Flag Tag on SDS-PAGE; Right: Elisa plates were pre-coated with N-MBP Tag, C-Flag Tag MBP-GPR75-Nanodisc and anti-GPR75 monoclonal antibody (DMC100368).
3.3 Strep標(biāo)簽
Strep標(biāo)簽（Streptavidin標(biāo)簽）是一種常用的親和標(biāo)簽，基于Streptavidin和其配體生物素的高親和力作用，常用于蛋白的純化和捕獲。Strep標(biāo)簽在膜蛋白表達(dá)和純化中的優(yōu)勢包括：
高親和力純化：Strep標(biāo)簽與Streptavidin樹脂具有非常高的親和力（Kd ≈ 10^-14 M），能夠在較低濃度下有效純化目標(biāo)蛋白。這使得在不干擾膜蛋白天然構(gòu)象的情況下，獲得高純度的目標(biāo)蛋白。
標(biāo)簽體積?。?/strong>Strep標(biāo)簽較?。s8 kDa），對膜蛋白結(jié)構(gòu)和功能干擾較少，無需去除標(biāo)簽即可用于下游實(shí)驗(yàn)。
易于檢測：Strep標(biāo)簽可以與標(biāo)記的Streptavidin（熒光、酶等）結(jié)合，便于檢測和分析膜蛋白的表達(dá)和純度。這在膜蛋白表達(dá)的監(jiān)控和下游應(yīng)用中非常有用。
適用于多種檢測系統(tǒng)：Strep標(biāo)簽蛋白非常適用于在ELISA，SPR或BLI等檢測系統(tǒng)中蛋白質(zhì)的固定和檢測。
Human GPR75-Strep full length protein-synthetic nanodisc (Cat# FLP120031)
Left: Human GPR75-Strep-Nanodisc, C-Flag&Strep Tag on SDS-PAGE; Middle: Elisa plates were pre-coated with C-Flag&Strep Tag GPR75-Strep-Nanodisc and and anti-GPR75 monoclonal antibody (DMC100368); Right: WB analysis of GPR75-Strep-Nanodisc with anti-GPR75 monoclonal antibody (DMC100368).
3.4?β2AR&BRIL融合蛋白
β2-腎上腺素受體（β2AR）是β-腎上腺素受體家族的一員，屬于GPCR類。純化過程中，由于GPCR在膜中的功能和構(gòu)象依賴于膜脂質(zhì)的環(huán)境，因此保持膜蛋白的穩(wěn)定性和功能是關(guān)鍵問題。研究發(fā)現(xiàn)，改變N端殘基可能導(dǎo)致受體在膜中的嵌入方式發(fā)生變化，從而改變受體與配體結(jié)合的親和力。GPR75和β2AR都屬于G蛋白偶聯(lián)受體，且它們在結(jié)構(gòu)上具有一定的相似性，通過將N端替換為β2AR的序列，可增加GPR75表達(dá)量。
BRIL來源于細(xì)菌細(xì)胞色素b562（cytochrome b562），其具有一個(gè)緊密折疊的α螺旋結(jié)構(gòu)，突變使其更加穩(wěn)定，并且對溫度和溶液環(huán)境具有較高耐受性。BRIL具有雙重特性：在血紅素結(jié)合區(qū)域高度靈活，但在遠(yuǎn)端部分具有非常穩(wěn)定且剛性的核心，這確保了快速折疊動力學(xué)和折疊穩(wěn)定性。這種雙重特性使BRIL成為在膜蛋白的螺旋之間環(huán)區(qū)域進(jìn)行融合的理想伴侶，因?yàn)樗梢暂p松地適應(yīng)兩種蛋白質(zhì)的螺旋之間的輕微橫向錯(cuò)位，同時(shí)有助于折疊動力學(xué)和穩(wěn)定性。因此，通過將BRIL序列替換掉原來的ICL3環(huán)（237-306），以增強(qiáng)受體的穩(wěn)定性。
Human β2AR-GPR75-BRIL full length protein-synthetic nanodisc (Cat#FLP100031A)
Left: Human β2AR-GPR75-BRIL-Nanodisc, Flag Tag on SDS-PAGE; Right: Elisa plates were pre-coated with Flag Tag β2AR-GPR75-BRIL-Nanodisc and anti-Flag monoclonal antibody.
4. GPR75靶點(diǎn)系列產(chǎn)品
為助力生物醫(yī)藥開發(fā)，締碼開發(fā)了一系列針對GPR75靶點(diǎn)的產(chǎn)品，涵蓋胞外域重組蛋白，全長膜蛋白，自主研發(fā)的單克隆抗體，生物素和PE熒光標(biāo)記抗體以及穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株。除了現(xiàn)有的產(chǎn)品，締碼還可提供專業(yè)的蛋白（不同種屬/標(biāo)簽）和抗體（人源化/親和力成熟）定制服務(wù)以滿足不同客戶的需求。此外，我們還制備了GPR75靶點(diǎn)的單B細(xì)胞種子庫，可以在短時(shí)間內(nèi)（~28天）快速地篩選出先導(dǎo)抗體分子。更多詳情，歡迎垂詢。
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