瞬時(shí)受體電位錨蛋白1 (TRPA1)一種非選擇性陽(yáng)離子通道，可透過(guò)Ca2+，從而提高細(xì)胞內(nèi)的Ca2+水平。TRPA1因其可對(duì)多種環(huán)境刺激物做出反應(yīng)以及參與疼痛感知和炎癥過(guò)程而特別受關(guān)注。不完全統(tǒng)計(jì)，目前，全球針對(duì)TRPA1靶點(diǎn)的在研藥物共有22款（21款是小分子），其中進(jìn)入臨床的有6款。目前關(guān)于TRPA1藥物的最新動(dòng)態(tài)還是2023年禮來(lái)在第一季度季報(bào)中表明要放棄的一項(xiàng)止痛藥TRPA1拮抗劑臨床試驗(yàn)。今天我們就來(lái)聊聊目前TRPA1藥物的臨床研究進(jìn)展，在此之前，我們先來(lái)了解下TRPA1的背景知識(shí)。
1、TRPA1的分布
瞬時(shí)受體電位（TRP）蛋白家族是一類位于細(xì)胞膜上的非選擇性門控陽(yáng)離子通道。根據(jù)其氨基酸序列的同源性，哺乳動(dòng)物TRP通道可分為七個(gè)亞家族，包括TRPC、TRPV、TRPM、TRPP、TRPML、TRPA和TRPN [1]。瞬時(shí)受體電位錨蛋白1（TRPA1，又稱ANKTM1）是TRPA亞家族的唯一成員，是一種Ca2+可滲透的非選擇性陽(yáng)離子通道，在不同類型的疼痛中起重要作用。TRPA1主要在三叉神經(jīng)節(jié)、迷走神經(jīng)節(jié)和背根神經(jīng)節(jié)的初級(jí)感覺神經(jīng)元亞群以及巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和肥大細(xì)胞等非神經(jīng)元細(xì)胞中大量表達(dá) [2]。此外，也有研究表明TRPA1在肽能（富含神經(jīng)肽CGRP和SP以及神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子受體TrkA）和非肽能神經(jīng)元（共表達(dá)嘌呤受體P2X3、Neurturin、Artemin、Mrg家族的G蛋白耦聯(lián)受體以及GDNF受體家族中的GFRα1和GFRα2）均有表達(dá) [3]。近些年，在一些非神經(jīng)細(xì)胞（如內(nèi)爾毛細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞、牙髓成纖維細(xì)胞角質(zhì)細(xì)胞、胰島細(xì)胞等）上也發(fā)現(xiàn)了TRPA1的表達(dá) [4]。
2、TRPA1的結(jié)構(gòu)
TRPA1基因是在1999年從肺成纖維細(xì)胞中克隆出來(lái)的。人的TRPA1由1119個(gè)氨基酸組成，位于人類8號(hào)染色體q13，相對(duì)分子質(zhì)量約127kDa。如圖1所示，TRPA1跨膜蛋白有6個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域（S1-S6）和1個(gè)孔道組成，其N末端和C末端均在胞內(nèi)。S1和S2形成細(xì)胞外環(huán)結(jié)構(gòu)，S5和S6跨膜結(jié)構(gòu)域親水區(qū)形成孔道。TRPA1蛋白的長(zhǎng)NH2末端包含TRP超家族中最普遍的錨蛋白重復(fù)結(jié)構(gòu)域（ARD），包括14-16個(gè)錨蛋白重復(fù)序列，每個(gè)錨蛋白重復(fù)序列由約33個(gè)氨基酸長(zhǎng)度的α-helix-β-turn-α-helix基序組成[5]，可能參與蛋白間相互作用，如與磷脂酶C （PLC）和鈣（Ca2+）的結(jié)合。ARD通過(guò)pre-S1區(qū)與TM1連接，其中含有一些半胱氨酸殘基（如Cys621、Cys641和Cys665），這些殘基對(duì)于親電激動(dòng)劑激活TRPA1至關(guān)重要。N末端有1個(gè)EF手性結(jié)合域，能夠增加細(xì)胞內(nèi)鈣離子。TRPA1可被辣根、肉桂醛、大麻、蒜素、芥末、質(zhì)子等眾多外源性有機(jī)小分子激活,但是對(duì)薄荷醇無(wú)反應(yīng)。
圖1. TRPA1分子結(jié)構(gòu)[6]
3、疼痛中TRPA1的作用機(jī)理
TRPA1通道由2021年諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)得主Ardem Patapoutian教授發(fā)現(xiàn)，是一類非選擇性配體門控陽(yáng)離子通道，參與感知傷害性刺激和傳導(dǎo)傷害性信號(hào)。TRPA1可以通過(guò)三種不同的方式被外源刺激激活：外源刺激通過(guò)G蛋白偶聯(lián)受體（GPCR）和受體酪氨酸激酶（RTK）激活蛋白激酶C （PKC），調(diào)節(jié)TRPA1通道的活性；低分子量有機(jī)物和內(nèi)源性酯類作為TRPA1的配體激活通道；溫度變化和機(jī)械刺激直接作用于TRPA1通道，促進(jìn)其打開和激活。TRPA1通道的激活或致敏，增加Ca2+內(nèi)流，促進(jìn)神經(jīng)源性炎癥反應(yīng)和神經(jīng)肽的釋放，如P物質(zhì)（SP）、神經(jīng)激肽A（NKA）和降鈣素二烯相關(guān)肽（CGRP）。
多項(xiàng)研究已證實(shí)TRPA1在介導(dǎo)痛覺性和神經(jīng)性疼痛模型中對(duì)熱、化學(xué)和機(jī)械刺激的長(zhǎng)期超敏反應(yīng)中扮演重要角色。McNamara CR等人首次證實(shí)了TRPA1參與炎性傷害感受。該研究表明在藥理學(xué)拮抗作用或TRPA1通道基因缺失后，福爾馬林在大鼠和小鼠爪子中誘導(dǎo)的傷害感受反應(yīng)減少[8]。而且，在角叉菜膠和完全弗氏佐劑誘導(dǎo)的動(dòng)物模型中，緊急抑制TRPA1可降低與持續(xù)炎癥相關(guān)的冷和機(jī)械超敏反應(yīng) [9]。此外，TRPA1也被證實(shí)有助于外周和中樞神經(jīng)性疼痛。在鏈脲佐菌素誘發(fā)的糖尿病神經(jīng)病變嚙齒動(dòng)物模型中，TRPA1拮抗劑可減少機(jī)械性異常痛和超敏反應(yīng)[10] [11]。
4、當(dāng)前臨床階段TRPA1靶向藥的研究進(jìn)展
釕紅、慶大霉素和阿米洛利和釓是文獻(xiàn)中最早報(bào)道的TRPA1通道拮抗劑，這些非特異性通道阻滯劑已被更具選擇性的TRPA1拮抗劑所取代。TRPA1作為離子通道類的鎮(zhèn)痛靶點(diǎn)，沒(méi)有阿片類藥物的成癮濫用風(fēng)險(xiǎn)。由于處于疼痛信號(hào)通路的上游，其靶向藥物在阻斷疼痛信號(hào)的同時(shí)，并不會(huì)影響機(jī)體的感覺模式。結(jié)合其在中樞神經(jīng)和心臟中的表達(dá)豐度很低的特點(diǎn)，這樣進(jìn)一步降低了中樞神經(jīng)和心臟副作用的風(fēng)險(xiǎn)，與其它鎮(zhèn)痛靶點(diǎn)相比具有優(yōu)越性。如前所述，當(dāng)前處于臨床階段的靶向TRPA1藥物共計(jì)6款，處于臨床申請(qǐng)階段的有1款，已獲得臨床審批的有一款。
| 藥物 | 公司 | 適應(yīng)癥 | 研發(fā)階段 |
| GRC-17536 | Glenmark Pharmaceuticals Ltd.Ichnos Sciences SA | 糖尿病周圍神經(jīng)病變 | 臨床II期 |
| LY-3526318 | Eli Lilly & Co. | 糖尿病周圍神經(jīng)性疼痛、慢性疼痛 | 臨床II期 |
| RG-6341 | Genentech, Inc.Roche Holding AG | 難治性慢性咳嗽、不明原因的慢性咳嗽、哮喘 | 臨床II期 |
| HX-100 | Hydra Biosciences, Inc. | 哮喘 | 臨床I期 |
| LD-2020 | 上海璃道醫(yī)藥科技有限公司 | 關(guān)節(jié)炎疼痛、癌癥疼痛 | 臨床I期 |
| A-967079 | Abbott Laboratories | 疼痛 | 早期臨床1期 |
| LD-09163 | 上海璃道醫(yī)藥科技有限公司 | 炎癥性腸病、潰瘍性結(jié)腸炎、克羅恩病 | 臨床申請(qǐng)批準(zhǔn) |
| LD-04185 | 上海璃道醫(yī)藥科技有限公司 | 纖維肌痛、神經(jīng)痛 | 臨床申請(qǐng) |
- GRC 17536
GRC 17536（又稱ISC 17536）也是一種可口服的TRPA1通道小分子拮抗劑，目前是由Glenmark Pharmaceuticals在推進(jìn)臨床開發(fā)。臨床前研究已經(jīng)證明GRC 17536在神經(jīng)性和炎癥性疼痛動(dòng)物模型中的有效性，包括糖尿病外周神經(jīng)性疼痛、骨關(guān)節(jié)炎疼痛、術(shù)后疼痛和化療引起的疼痛，這些結(jié)果也驗(yàn)證了TRPA1阻斷劑在治療性疼痛管理中的潛在效用。2014年9月，Glenmark宣布已在IIa期疼痛性糖尿病外周神經(jīng)病概念驗(yàn)證研究中取得了積極的成果，在亞組中至重度糖尿病性神經(jīng)病性疼痛患者中具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義和臨床相關(guān)反應(yīng)。GCR 17536目前被FDA暫停臨床使用，官方材料預(yù)計(jì)在2019年下半年恢復(fù)臨床臨床試驗(yàn)。需要注意的是，該條管線已從Glenmark Pharmaceuticals官網(wǎng)上移除。
- LY-3526318
如前所述，LY-3526318最初是由Hydra Biosciences原研，于2018年開始由禮來(lái)來(lái)推進(jìn)臨床試驗(yàn)。LY-3526318（又稱為L(zhǎng)Y356318）是TRPA1小分子拮抗劑。2022年10月13日，禮來(lái)在美國(guó)和波多黎各完成骨關(guān)節(jié)炎、慢性腰痛和神經(jīng)性疼痛的II期臨床試驗(yàn)。2022年10月14日，禮來(lái)計(jì)劃在日本健康志愿者中進(jìn)行I期安全性和藥代動(dòng)力學(xué)試驗(yàn)。但2023年1月9日，禮來(lái)公司撤回了一項(xiàng)在日本招募健康志愿者（PO）之前的I期試驗(yàn)，官方給出的回復(fù)是因?yàn)樯虡I(yè)決定。
- RG-6341
RG-6341，又稱為GDC-6599，是羅氏開發(fā)的一款TRPA1抑制劑。臨床前實(shí)驗(yàn)表明，GDC -6599在豚鼠肉桂醛誘發(fā)的咳嗽研究和AITC誘發(fā)的真皮血流模型中表現(xiàn)出強(qiáng)大的靶向作用。該分子是首個(gè)達(dá)到臨床IIa期 ( NCT05660850)的口服TRPA1拮抗劑，用于治療慢性咳嗽。
盡管多年來(lái)在整個(gè)制藥行業(yè)進(jìn)行了大量的TRPA1的研究，但只有GRC 17536和RG-6341進(jìn)入了II期臨床試驗(yàn)的終點(diǎn)。默沙東的CB 189625和Orion的ODM108均因藥代不佳而終止，主因是溶解性較差和生物利用度較低。反觀國(guó)內(nèi)，目前只有璃道生物TRPA1拮抗劑LD-2020進(jìn)展最快，當(dāng)前已經(jīng)在中國(guó)進(jìn)入臨床I期試驗(yàn)（CTR20240694），不過(guò)值得注意的是，璃道生物同時(shí)還有另外兩款TRPA1抑制劑（LD-09163和LD-04185）分別處于臨床申請(qǐng)批準(zhǔn)和臨床申請(qǐng)階段，是目前國(guó)內(nèi)擁有TRPA1抑制劑管線最多的公司。
5、締碼全長(zhǎng)TRPA1蛋白，助力新藥研發(fā)
如前所述，TRPA1是6次跨膜的通道蛋白，無(wú)論是抗體藥還是小分子藥，首先獲得有活性的全長(zhǎng)膜蛋白是至關(guān)重要的。締碼生物利用自主研發(fā)的Synthetic Nanodisc膜蛋白表達(dá)技術(shù)平臺(tái)已開發(fā)出全長(zhǎng)的人TRPA1蛋白。與市面上大多數(shù)MSP（膜支持蛋白）Nanodisc不同，締碼生物研發(fā)的Synthetic Nanodisc是基于真核表達(dá)系統(tǒng)，能直接從完整的細(xì)胞中制作。在這個(gè)過(guò)程中，使用的合成高分子具有雙重功能。首先，它溶解細(xì)胞膜，類似于洗滌劑，然后利用天然細(xì)胞磷脂在膜蛋白周圍形成納米盤結(jié)構(gòu)。跨膜蛋白可整合到Nanodiscs中。目前，締碼生物已利用Nanodiscs全長(zhǎng)膜蛋白平臺(tái)開發(fā)了數(shù)百種膜蛋白，點(diǎn)擊這個(gè)可查看所有膜蛋白。
Human TRPA1 full length protein-synthetic nanodisc?(FLP100033)
[Right] Human TRPA1-Nanodisc, Flag Tag on SDS-PAGE
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