一提到DLL3，大家都會想到讓艾伯維58億美金期待落空的DLL3靶點的ADC藥物Rova-T。艾伯維的折戟也曾一度讓DLL3靶向治療的熱度下降，但是安進在2023年ESMO上公布的DLL3/CD3雙抗Tarlatamab數(shù)據(jù)，讓人眼前一亮。同年12月13日，安進還宣布Tarlatamab的BLA申請獲FDA受理并獲優(yōu)先審評資格。消息一經(jīng)發(fā)布，靶向DLL3療法熱度持續(xù)高漲。那DLL3究竟是什么？目前還有哪些藥企布局了靶向DLL3的治療管線？

1、DLL3的結(jié)構(gòu)與分布

Delta樣配體3（Delta-Like Ligand 3, DLL3）是Delta樣配體（Delta-like ligands，DLLs）家族成員之一。DLLs是一種附著在細(xì)胞表面的單次跨膜蛋白，除了DLL3，該家族還有兩位成員DLL1和DLL4。編碼DLL1、DLL3和DLL4的基因分別位于染色體 6q27、19q13.2和 15q15.1上 [1]。人DLL3蛋白由619個氨基酸組成，其特征是一個由40個氨基酸組成的N端保守DSL （Delta,Serrate, Lag2）結(jié)構(gòu)域、6個EGF樣重復(fù)序列和一個跨膜結(jié)構(gòu)域，其中，SDL結(jié)構(gòu)域在配體家族中高度保守，是與Notch受體結(jié)合的必要結(jié)構(gòu)。如圖1所示，與DLL3不同的是，DLL1和DLL4有8個EGF樣重復(fù)序列，而且DLL1和4的C端還存在PDZ結(jié)合基序，這是DLL3所缺乏的 [2]。DLL3在進化過程中高度保守，人和鼠DLL3蛋白序列同源性可達82%。

Figure 1. The structure of DLLs [1]

DLL3 RNA主要表達在腦部，內(nèi)分泌組織以及血液；DLL3單在正常組織中幾乎不表達。研究發(fā)現(xiàn)，DLL3在大約80%的小細(xì)胞肺癌 (SCLC) 和其他神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤中高表達。正常細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞中DLL3的差異表達使其成為有吸引力的腫瘤選擇性治療靶點。

2、DLL3與Notch信號通路

DLL3是Notch信號通路的抑制性配體[3]，在Notch信號傳導(dǎo)中發(fā)揮關(guān)鍵作用。Notch通路是高度保守的細(xì)胞間信號傳導(dǎo)通路，涉及生長發(fā)育的多個過程，比如多能祖細(xì)胞的分化、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞增殖及細(xì)胞邊界的形成等。

一般情況下，Notch信號通路通過局部細(xì)胞間相互作用調(diào)節(jié)細(xì)胞命運。哺乳動物中有四種 Notch受體(Notch1、Notch2、Notch3、Notch4) 和五種Notch配體（DLL1、3、4和Jagged 1–2）。Notch受體在高爾基體中被furin蛋白酶切割（S1切割）成2個片段后會轉(zhuǎn)運到細(xì)胞表面并形成跨膜異二聚體。當(dāng)與相鄰細(xì)胞上的Notch配體相互作用后，Notch受體又會發(fā)生兩次斷裂，先是被ADAM10/17在靠近胞膜外的部位催化肽鍵斷裂（S2裂解），然后再由γ-分泌酶復(fù)合物（S3裂解）在靠近胞膜內(nèi)的部位進行切割，從而釋放Notch胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域(NICD)。釋放的NICD隨會進入細(xì)胞核與DNA結(jié)合蛋白CSL（CBF-1）結(jié)合形成NICD/CSL轉(zhuǎn)錄激活復(fù)合體。該復(fù)合體隨后會招募MAML（Mastermind-likeprotein）并激活轉(zhuǎn)錄Notch靶向的基因，包括Hes、Hey、HERP等轉(zhuǎn)錄抑制因子家族 [4] [5]。

DLLs在轉(zhuǎn)運到細(xì)胞膜前，在高爾基體中經(jīng)O-巖藻糖修飾，以增加或者減弱DLL-Notch信號。細(xì)胞膜上的DLL結(jié)合EGF后，通過胞吞作用順勢激活Notch信號。被胞吞后的DLLs然后被蛋白酶或者溶酶體降解，或者循環(huán)后被轉(zhuǎn)運到細(xì)胞膜表面。胞吞后的DLLs的降解或者是再循環(huán)由泛素化DLL胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域控制（DICD）。DLLs除了可以激活Notch信號外，還可以通過多種途徑抑制Notch信號。

Figure 2. Notch ligands and Notch signaling [6]

再回到DLL3，與其他哺乳動物Notch家族成員不同，在正常發(fā)育過程中，DLL3定位于高爾基體和細(xì)胞質(zhì)囊泡，與未加工的全長Notch1和DLL1相互作用，阻止它們定位在細(xì)胞表面，從而對Notch信號產(chǎn)生抑制。

3、DLL3與小細(xì)胞肺癌

小細(xì)胞肺癌（SCLC）是一種低分化的神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤，是侵襲性最強的一類肺癌，SCLC的發(fā)生進展與 Notch信號通路密切相關(guān)，該通路調(diào)節(jié)許多正常發(fā)育所必需的基本過程，此通路失活突變可以誘導(dǎo)非神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤細(xì)胞或腫瘤前體細(xì)胞神經(jīng)內(nèi)分泌分化。DLL3是Notch信號通路的唯一抑制性配體，在85%的SCLC中高表達，但在正常肺組織中不表達。這表明DLL3可能與神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤發(fā)生有關(guān)，但其作用機制暫不清楚。此外，DLL3是 achaete-scute 同源物 1 (ASCL1) 的下游靶標(biāo)，在神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞分化和SCLC 生長中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。Furuta M [7]等人在一項研究中證明，DLL3過度表達可促進SCLC細(xì)胞的生長并增強其遷移和侵襲能力。Deng等也同樣發(fā)現(xiàn)在小鼠 Lewis肺癌(LLC)細(xì)胞中，DLL3通過促進Akt蛋白磷酸化并抑制Notch受體促進了細(xì)胞增殖減少細(xì)胞凋亡，從而增強小鼠體內(nèi)的腫瘤生長[8]。除了SCLC，DLL3在大細(xì)胞神經(jīng)內(nèi)分泌肺癌（LCNEC）、某些其他部位神經(jīng)內(nèi)分泌癌和前列腺癌中也表現(xiàn)出高度上調(diào)并在細(xì)胞表面異常表達，這種差異性異位表達使其成為了潛在的治療靶點。

4、DLL3靶向療法臨床研究進展

目前，靶向DLL3的療法共計16項，其中15項在臨床階段，1項處于臨床前階段。療法類型多樣，包括抗體偶聯(lián)藥物（Antibody-drug conjunct, ADC）、CAR-T、蛋白和抗體藥。

4.1 DLL3-ADC

Rova-T，全稱為Rovalpituzumab tesirine，是一款靶向DLL3的ADC藥物。該款A(yù)DC藥物最初由Stemcentrx原研，2016年AbbVie以58億美元首付款收購了Stemcentrx，然后接力繼續(xù)Rova-T的臨床開發(fā)。目前最新動態(tài)是終止開發(fā)，針對的適應(yīng)癥為SCLC。Rova-T是由DLL3特異性人源化單克隆抗體通過可裂解的二肽連接子與吡咯并二氮茚（PBD）二聚體毒素偶聯(lián)。Rova-T通過與細(xì)胞表面DLL3結(jié)合觸發(fā)受體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用。內(nèi)吞作用使Rova-T-DLL3復(fù)合物內(nèi)化進細(xì)胞，然后與溶酶體融合。在溶酶體相關(guān)組織蛋白酶的作用下，Rova-T 的纈氨酸-丙氨酸接頭被裂解，PBD從復(fù)合物中釋放到細(xì)胞質(zhì)中。細(xì)胞質(zhì)中的PDB隨后會進入細(xì)胞核，以位點特異性方式插入DNA之間并引起DNA損傷，最終通過細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)細(xì)胞死亡 [9]。

Figure 3. Mechanism of action of Rova-T [10]

Rova-T已開展了至少10項臨床試驗，包括兩項3期臨床。2016年，Rova-T的首次人體研究在二三線治療的SCLC患者中產(chǎn)生了18%的客觀響應(yīng)率（ORR），1年生存率為36%，這一結(jié)果給業(yè)界帶來了極大的振奮，曾一度讓DLL3靶點熱度持續(xù)高漲?；谠摻Y(jié)果，AbbVie直接跳過II期臨床研究開展了III期研究，但遺憾的是兩項III期研究均因未達到預(yù)先指定的中期PFS和/或OS主要終點而提前終止。結(jié)合結(jié)果分析及其他因素考量，AbbVie宣布中斷Rova-T的開發(fā)。

FZ-AD005，是由復(fù)旦張江利用其Linker-Drug平臺（BB05平臺）第三個新一代ADC產(chǎn)品。該ADC產(chǎn)品通過BB05將重組人鼠嵌合抗DLL3單克隆抗體與拓?fù)洚悩?gòu)酶I抑制劑偶聯(lián)而成，該藥已于2023年12月22日獲批臨床，擬開發(fā)用于治療晚期實體瘤，包括但不限于小細(xì)胞肺癌、大細(xì)胞神經(jīng)內(nèi)分泌癌、前列腺癌等。

YL212，又稱ZL-1310，是由宜聯(lián)生物具有自主知識產(chǎn)權(quán)的TAMLIN ?技術(shù)平臺研發(fā)的一款DLL3 ADC產(chǎn)品。TMALIN?平臺為新型抗體偶聯(lián)藥物平臺技術(shù)，其特點為利用腫瘤微環(huán)境來克服當(dāng)前ADC藥物所面臨的挑戰(zhàn)。不同于傳統(tǒng)的胞內(nèi)裂解，YL212具有胞外及胞內(nèi)裂解的雙重機制，是一款基于新型ADC技術(shù)的候選分子。2023年4月27日，再鼎醫(yī)藥和宜聯(lián)生物就YL212達成戰(zhàn)略合作及全球許可協(xié)議。2023年12月1日，CDE官方顯示，再鼎醫(yī)藥提交注射用ZL-1310的臨床申請獲得受理。目前正處于臨床I期，針對的適應(yīng)癥是癌癥。

4.2 DLL3雙抗

AMG 757，又稱Tarlatamab，是由Amgen開發(fā)的一款靶向DLL3和CD3的雙抗。于2023年12月BLA申請獲FDA受理并獲優(yōu)先審評資格，適應(yīng)癥為二線小細(xì)胞肺癌，有望成為全球首款CD3/DLL3雙抗。Tarlatamab是一種雙特異性T細(xì)胞接合器（TCE），對腫瘤細(xì)胞上的 DLL3 和 T 細(xì)胞上的 CD3 具有雙重親和力。這種雙重結(jié)合使腫瘤細(xì)胞與自體T細(xì)胞緊密結(jié)合，觸發(fā)免疫突觸的形成和T 細(xì)胞激活，并啟動多克隆T細(xì)胞反應(yīng)，其特征是 CD3 聚集、T 細(xì)胞增殖和釋放成孔顆粒酶和穿孔素。這一系列事件最終導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞凋亡和T細(xì)胞反應(yīng)放大。 Tarlatamab分子由兩個單鏈可變片段（scFv）組成，并包括一個穩(wěn)定的、無效應(yīng)器功能的Fc結(jié)構(gòu)域，以增加半衰期。目前，有六項正在進行的臨床研究正在評估Tarlatamab。

Figure 4. The structure of action of Tarlatamab [10]

QLS31904，由齊魯制藥自主研發(fā)，是一款靶向DLL3/CD3的TCE雙特異性抗體。該藥包括抗DLL3的特異性Fab片段、抗CD3的scFv片段和修飾的Fc區(qū)，以支持異二聚體。目前正處于臨床I期，擬用于治療小細(xì)胞肺癌等晚期實體瘤。

Figure 5. The structure of action of QLS31904 [10]

BI764532，由勃林格殷格翰研發(fā)，也是一款具有IgG骨架靶向DLL3/CD3的TCE雙特異性抗體。2023年10月，BI 764532獲得FDA授予的快速通道資格認(rèn)證，治療廣泛期小細(xì)胞肺癌（SCLC）以及晚期或轉(zhuǎn)移性肺外神經(jīng)內(nèi)分泌癌（NEC）。目前，BI764532處于２期臨床。

Figure 6. The structure of action of BI764532 [10]

PT-217，由Phanes Therapeutics自主研發(fā)，是一款具有天然IgG結(jié)構(gòu)靶向DLL3和CD47的雙抗。PT217可通過巨噬細(xì)胞的ADCP活性和NK細(xì)胞的ADCC活性直接殺傷腫瘤細(xì)胞，并通過同時靶向腫瘤細(xì)胞表面過度表達的DLL3和CD47擴大腫瘤殺傷范圍。此外，PT217有望通過引導(dǎo)腫瘤細(xì)胞進入吞噬性抗原呈遞細(xì)胞（APCs）來誘導(dǎo)腫瘤新抗原的呈遞，并通過識別腫瘤新抗原，間接激活T細(xì)胞對低表達或不表達DLL3的腫瘤細(xì)胞的殺傷，從而刺激獲得性免疫系統(tǒng)。PT217的抗CD47單臂具有高度差異化，并且已經(jīng)在臨床前模型中顯示，其在與人紅細(xì)胞最小程度結(jié)合的同時，又保持很強的與腫瘤細(xì)胞上CD47的結(jié)合活性。PT217已于2022年獲得美國食品藥品監(jiān)督管理局（FDA）批準(zhǔn)在美國開展一項多中心臨床I期試驗（臨床登記號NCT05652686），并于2022年獲得了FDA授予的孤兒藥資格認(rèn)定，用于治療小細(xì)胞肺癌。

4.3 DLL3三抗

HPN328，是由Harpoon利用其專有的三特異性T細(xì)胞激活構(gòu)建物（TriTAC?）平臺構(gòu)建的一款三特異性抗體，包括三個人源化抗體衍生的結(jié)構(gòu)域：結(jié)合腫瘤細(xì)胞上DLL3的N端結(jié)構(gòu)域、結(jié)合人血清白蛋白的中間結(jié)構(gòu)域（用于半衰期延長）和結(jié)合CD3的C端結(jié)構(gòu)域。HPN328目前正在進行一項1/2期臨床試驗，該試驗旨在評估HPN328單藥治療攜帶DLL3表達的晚期癌癥患者的安全性、耐受性和藥代動力學(xué)。2024年1月9日，默沙東（MSD）公司宣布將斥資約6.8億美元收購Harpoon Therapeutics。自此，默沙東將獲得一系列T細(xì)胞接合器在研療法，其中包括HPN328，旨在擴展其腫瘤學(xué)研發(fā)管線。

Figure 7. The structure of action of HPN328 [10]

ZG006，由澤璟制藥開發(fā)，是一款針對CD3及兩個不同DLL3表位的三特異性抗體（CD3×DLL3×DLL3）。臨床前研究顯示，在小鼠腫瘤模型上，ZG006具有顯著的腫瘤抑制作用，使小鼠腫瘤完全消退。在非人靈長類動物中，ZG006顯示出毒副作用低等良好的安全性特征。目前，ZG006正在進行一項1/2期臨床試驗，針對的適應(yīng)癥為SCLC。

4.4 DLL3 CAR-T

AMG 119，由Amgen開發(fā)的一種CAR-T細(xì)胞療法，包括編碼抗DLL3的結(jié)構(gòu)域、CD28和4-1BB共刺激結(jié)構(gòu)域以及CD3胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域。2019年12月，該藥被FDA授予孤兒藥資格。2023年9月，AMG119在小細(xì)胞肺癌患者中的臨床治療概況和PK特征發(fā)表在《J Clin Pharmacol》雜志上，結(jié)果顯示AMG119表現(xiàn)出較強的細(xì)胞擴增能力，具有較好的細(xì)胞持久性和良好的反應(yīng)力，并在測試劑量下具有臨床安全性和良好的耐受性，沒有劑量限制毒性(DLT)。目前，該藥正處于臨床I期。

ALLO-213，是由Allogene開發(fā)的一款靶向DLL3的同種異體CAR-T，目前尚未啟動臨床。

LB-2102，是由南京傳奇開發(fā)的一款靶向DLL3雙表位的CAR-T 療法。LB2102使用了VHH抗體技術(shù)和克服腫瘤微環(huán)境抑制因素的“武裝”CAR-T技術(shù)。它攜帶著兩個識別DLL3的VHH抗體片段，和一個能被腫瘤微環(huán)境中信號激活的跨膜蛋白。2023年6月被FDA授予治療SCLC的孤兒藥資格。 同年11月 ，諾華與傳奇生物就LB2102簽訂獨家全球許可協(xié)議。

4.5 DLL3 CAR-NK

DLL3 CAR-NK cells是由天津市腫瘤醫(yī)院開發(fā)的一款DLL3 CAR-NK療法，包含抗DLL3的scFv結(jié)構(gòu)域、NKG2D跨膜結(jié)構(gòu)域和2B4-CD3結(jié)構(gòu)域，目前正在針對復(fù)發(fā)/難治性ES-SCLC患者進行I期臨床試驗招募。

5、締碼DLL3相關(guān)產(chǎn)品與服務(wù)，助力DLL3生物療法開發(fā)

締碼生物科技有限公司是一家專注于可成藥靶點臨床前研發(fā)產(chǎn)品和服務(wù)的生物技術(shù)公司。締碼現(xiàn)可提供DLL3靶點全系列產(chǎn)品與服務(wù)。產(chǎn)品包括活性蛋白、參照抗體和流式驗證單克隆抗體；服務(wù)包括多種屬蛋白抗體定制服務(wù)、抗體人源化和親和力成熟服務(wù)。此外，為加速DLL3生物療法的開發(fā)，締碼還制備了DLL3靶點單B細(xì)胞種子庫，最快28天可獲得先導(dǎo)抗體分子；同時，我們也針對部分現(xiàn)有的DLL3先導(dǎo)抗體分子進行了CAR-T或ADC分子構(gòu)建及功能驗證，具體數(shù)據(jù)歡迎垂詢。

• 重組活性蛋白

Human DLL3 Protein, hFc Tag (PME100607)

Figure 8. The validated data of PME100607. The purity of the protein is greater than 80% as determined by SDS-PAGE and Coomassie blue staining (left). ELISA plate pre-coated by 2 μg/mL (100 μL/well) Human DLL3 Protein, hFc Tag (PME100607) can bind Anti-DLL3(Rovalpituzumab biosimilar) mAb (BME100068) in a linear range of 0.64–80 ng/mL (right).

• 參照抗體

Anti-DLL3(Rovalpituzumab biosimilar) mAb (BME100068)

• 流式驗證單克隆抗體

Anti-DLL3 antibody(67E6), IgG1 Chimeric mAb (DMC101089)

• DLL3產(chǎn)品列表

產(chǎn)品類型	產(chǎn)品貨號	產(chǎn)品名稱
多表位重組蛋白	PME101498	Human DLL3(352-492) Protein, hFc Tag
多表位重組蛋白	PME101499	Human DLL3(390-492) Protein, hFc Tag
多表位重組蛋白	PME101504	Human DLL3(311-492) Protein, hFc Tag
多表位重組蛋白	PME101505	Human DLL3(428-492) Protein, hFc Tag
多表位重組蛋白	PME101532	Human DLL3(176-215) Protein, hFc Tag
多表位重組蛋白	PME100060	Human DLL3 Protein, His Tag
多表位重組蛋白	PME100607	Human DLL3 Protein, hFc Tag
多表位重組蛋白	PME-C100062	Cynomolgus DLL3(272-488) Protein, His Tag
多表位重組蛋白	PME-C100063	Cynomolgus DLL3(309-488) Protein, hFc Tag
多表位重組蛋白	PME-C100064	Cynomolgus DLL3(388-488) Protein, hFc Tag
多表位重組蛋白	PME-C100065	Cynomolgus DLL3(426-488) Protein, hFc Tag
多表位重組蛋白	PME-C100066	Cynomolgus DLL3(350-488) Protein, hFc Tag
FC驗證抗體	DMC101089	Anti-DLL3 antibody(67E6), IgG1 Chimeric mAb
參照抗體	BME100068	Anti-DLL3(Rovalpituzumab biosimilar) mAb
生物素標(biāo)記抗體	DMC101089B	Biotinylated Anti-DLL3 antibody(67E6), IgG1 Chimeric mAb
生物素標(biāo)記抗體	BME100068B	Biotinylated Anti-DLL3(Rovalpituzumab biosimilar) mAb

• DLL3先導(dǎo)分子研究進展

參考文獻：
[1]Steinbuck MP, Winandy S. A Review of Notch Processing With New Insights Into Ligand-Independent Notch Signaling in T-Cells. Front Immunol. 2018 Jun 1;9:1230.
[2]Ascano JM, Beverly LJ, Capobianco AJ. The C-terminal PDZ-ligand of JAGGED1 is essential for cellular transformation. J Biol Chem. 2003 Mar 7;278(10):8771-9.
[3]Ladi E, Nichols JT, Ge W, et al. The divergent DSL ligand Dll3 does not activate Notch signaling but cell autonomously attenuates signaling induced by other DSL ligands. J Cell Biol. 2005 Sep 12;170(6):983-92.
[4]Wang MM. Notch signaling and Notch signaling modifiers. Int J Biochem Cell Biol. 2011;43(11):1550–1562.
[5]D’Souza B, Miyamoto A, Weinmaster G. The many facets of Notch ligands. Oncogene. 2008;27(38):5148–5167.
[6]Xiu MX, Liu YM, Kuang BH. The Role of DLLs in Cancer: A Novel Therapeutic Target. Onco Targets Ther. 2020 May 7;13:3881-3901.
[7]Furuta M, Kikuchi H, Shoji T, et al. DLL 3 regulates the migration and invasion of small cell lung cancer by modulating Snail. Cancer Science. 2019 May;110(5):1599-608.
[8]Deng S M, Yan X C, Liang L, et al. The notch ligand delta-like 3 promotes tumor growth and inhibits notch signaling in lung cancer cells in mice[ J]. Biochemical and Biophysical Research Communications，2017，483(1):488-494.
[9]Saunders LR, Bankovich AJ, Anderson WC, et al. A DLL3-targeted antibody-drug conjugate eradicates high-grade pulmonary neuroendocrine tumor-initiating cells in vivo. Sci Transl Med. 2015 Aug 26;7(302):302ra136.
[10]Rudin CM, Reck M, Johnson ML, Blackhall F, Hann CL, Yang JC, Bailis JM, Bebb G, Goldrick A, Umejiego J, Paz-Ares L. Emerging therapies targeting the delta-like ligand 3 (DLL3) in small cell lung cancer. J Hematol Oncol. 2023 Jun 24;16(1):66.