抗體偶聯(lián)藥物（Antibody-drug conjugates，ADC）主要由單克隆抗體、連接子和細胞毒素（又稱為有效載荷或Payload）三部分構(gòu)成。其中抗體作為ADC藥物的“導(dǎo)彈”，具有靶向功能，可以特異性識別腫瘤細胞表面抗原，與細胞表面抗原結(jié)合后發(fā)生內(nèi)吞，將細胞毒素帶到腫瘤細胞并發(fā)揮毒性效應(yīng)。由于一些抗體與抗原結(jié)合后不一定會被靶細胞內(nèi)吞，所以抗體內(nèi)化能力是ADC藥物早期篩選的一項重要指標。那抗體內(nèi)化的原理是什么？作用途徑有哪些？影響抗體內(nèi)化的因素又有哪些？目前抗體內(nèi)化的檢測方法又有哪些呢？

1、抗體內(nèi)化原理及途徑

如前所述，抗體內(nèi)化，也可以理解為抗體內(nèi)吞，是指在細胞表面的抗體與相應(yīng)的抗原結(jié)合后，通過自身分子運輸體系，將抗體和抗原復(fù)合物帶入細胞內(nèi)部，并在內(nèi)部起到特定的生物學(xué)作用。抗體內(nèi)化是大多數(shù)ADC藥物分子進入細胞的方式。常規(guī)內(nèi)吞作用可分為三個階段：芽形成；膜彎曲和囊泡成熟；以及膜分裂并釋放到細胞質(zhì)中。通過對當(dāng)前已上市ADC藥物內(nèi)化方式的分析（如下圖所示），ADC藥物內(nèi)化途徑可根據(jù)是否依賴網(wǎng)格蛋白分為兩類：一是網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞作用（CME）；二是網(wǎng)格蛋白非依賴性內(nèi)吞作用。其中，網(wǎng)格蛋白非依賴性內(nèi)吞作用會進一步分為小窩蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞作用、小窩蛋白非依賴性載體蛋白/GPI錨定蛋白富集的早期內(nèi)體區(qū)室 (CLIC/GEEC) 和巨胞飲作用。

Figure 1. collection of endocytosis pathways utilized by the target antigens for the currently approved ADCs [1]

這里我們重點介紹一下ADC藥物內(nèi)吞的主要途徑-網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞作用。網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞作用包括一些連續(xù)且部分重疊的步驟。不同受體的CME觸發(fā)機制并不一樣。CME可以由質(zhì)膜上的某些受體組成型啟動，也可以通過受體與配體和/或抗體結(jié)合來啟動。當(dāng)細胞質(zhì)里的內(nèi)吞衣殼蛋白開始在質(zhì)膜內(nèi)小葉上聚集時，CME就開始了。衣殼蛋白通過從細胞質(zhì)中募集額外的接頭蛋白并與其相互作用來繼續(xù)組裝和生長。關(guān)鍵的銜接蛋白使膜彎曲，從而將內(nèi)化受體/配體聚集到“網(wǎng)格蛋白包被坑”（CCP）中。由于CCP內(nèi)陷變大，CCP頸部會收縮，繼而通過一個斷裂過程與質(zhì)膜分離。肌動蛋白聚合有助于將CCP“向內(nèi)”拉入細胞質(zhì)，直到分裂完成，CCP被釋放并成為網(wǎng)格蛋白包被的囊泡（CCV）。最后，CCV外殼被分解，CCV 與內(nèi)體融合并分選到特定的亞細胞位或循環(huán)回到細胞表面 [1]。

Figure 2. The mechanism of Clathrin-mediated endocytosis

2、影響抗體內(nèi)化的因素有哪些

抗體是否能被內(nèi)化主要由靶點決定，而抗體內(nèi)化的效率受到多方面因素的影響，主要因素包括抗體的親和力和特異性、抗體的類型和亞型、抗體的劑量和濃度及細胞的類型和狀態(tài)。

抗體的親和力和特異性：親和力高的抗體能更有效地與抗原結(jié)合，促進內(nèi)化。特異性高的抗體能更精確地識別抗原，避免非特異性結(jié)合。

抗體的類型和亞型：不同類型和亞型的抗體有不同的受體和信號通路，影響內(nèi)化的速度和效率。例如，IgG和IgA的內(nèi)化速度較快，而IgM和IgE的內(nèi)化速度較慢。

抗體的劑量和濃度：抗體的劑量和濃度越高，與抗原的結(jié)合越多，內(nèi)化的可能性越大。但是，過高的抗體劑量和濃度也可能導(dǎo)致受體飽和或下調(diào)，降低內(nèi)化的效果。

細胞的類型和狀態(tài)：不同類型的細胞有不同的受體表達和內(nèi)化能力，影響抗體內(nèi)化的差異。細胞的狀態(tài)也會影響內(nèi)化的動力學(xué)，例如，活化的細胞內(nèi)化速度較快，而凋亡的細胞內(nèi)化速度較慢。

此外，分子量較大的抗原通常更難被細胞內(nèi)化，而且，哪怕同一靶點的不同抗體也會表現(xiàn)出不同的內(nèi)化效率。所以，在ADC藥物研發(fā)過程中，篩選出高內(nèi)化效率的抗體是安全性的重要保證。

3、如何檢測抗體內(nèi)化

有多種常規(guī)方法用于抗體檢測內(nèi)化。根據(jù)檢測實驗類型可分為四大類，包括基于活細胞成像的內(nèi)化檢測、基于毒素偶聯(lián)的殺傷檢測、基于pH探針的內(nèi)化檢測和基于溫度轉(zhuǎn)變的熒光二抗內(nèi)化檢測。

基于活細胞成像的內(nèi)化檢測也稱為Incucyte，是通過實時活細胞成像儀對裸抗進行藥效動力學(xué)的實時檢測。不同于終點檢測，它是多濃度點、多時間點模式抗體內(nèi)化檢測的最佳選擇?？蓪罴毎麑崟r觀察，連續(xù)檢測可長達72小時。

基于毒素偶聯(lián)的殺傷檢測主要包括兩種方法，一種是DT3C法，一種是Mab-ZAP方法。二者都是通過抗體-毒素復(fù)合物在細胞內(nèi)釋放毒素然后引發(fā)細胞毒性。然后通過檢測細胞殺傷來評估抗體的內(nèi)化效果。DT3C是2014年MikiYamaguchi等人通過基因重組技術(shù)生產(chǎn)的一種重組蛋白，由一個沒有受體結(jié)合域的白喉毒素(DT)和鏈球菌蛋白G的C1、C2、C3 (3C)結(jié)構(gòu)域組成。Mab-ZAP由小鼠抗體和核糖體失活蛋白皂草素組成。與傳統(tǒng)的Mab-ZAP方法相比，DT3C法中mAb-DT3C偶聯(lián)物分子量更穩(wěn)定，內(nèi)化效率更高，適用性更廣，成本更低。

基于PH探針的內(nèi)化檢測和基于溫度轉(zhuǎn)變的熒光二抗內(nèi)化檢測是兩種常用的檢測細胞內(nèi)化過程的方法，它們都有各自的優(yōu)缺點?；赑H探針的內(nèi)化檢測是利用熒光探針對pH值的敏感性，來反映細胞內(nèi)囊泡的酸化程度，從而判斷內(nèi)化的進程和位置?；跍囟绒D(zhuǎn)變的熒光二抗內(nèi)化檢測是利用熒光二抗在不同溫度下的熒光強度變化，來區(qū)分細胞內(nèi)外的熒光信號，從而判斷內(nèi)化的效率和程度。兩種方法的優(yōu)缺點如下：

	基于PH探針的內(nèi)化檢測	基于溫度轉(zhuǎn)變的熒光二抗內(nèi)化檢測
優(yōu)點	方法簡便，操作方便，無需復(fù)雜的儀器和試劑； 熒光信號清晰，可定量分析，適用于高通量篩選； 可用于多種細胞類型和多種熒光標記物，如抗體、配體、藥物等。
缺點	需要選擇合適的pH敏感探針，以匹配不同的內(nèi)化通路和目標； 不同的pH探針有不同的pH響應(yīng)范圍和靈敏度，也有不同的熒光性質(zhì)和穩(wěn)定性； pH探針可能會受到其他因素的干擾，如細胞內(nèi)其他熒光物質(zhì)、細胞內(nèi)外的緩沖系統(tǒng)等。	需要控制好溫度的變化，以保證熒光信號的可靠性； 不同的熒光二抗有不同的溫度敏感性，也有不同的熒光性質(zhì)和穩(wěn)定性； 溫度轉(zhuǎn)變可能會影響細胞的生理狀態(tài)和內(nèi)化的動力學(xué)，也可能會影響熒光標記物的結(jié)合和釋放等。

4、締碼pH敏感試劑助力抗體內(nèi)化檢測

由締碼研發(fā)的DiTag PH敏感IgG標記試劑提供了一種易于測試抗體內(nèi)吞的解決方案。這兩款試劑（AME100001和AME100002）利用PH敏感熒光標記的Fc結(jié)合蛋白與來自不同物種的IgG抗體結(jié)合，導(dǎo)致熒光標記抗體-試劑復(fù)合物的形成。抗體內(nèi)吞后，周圍PH變?yōu)樗嵝?，抗體和標記試劑復(fù)合物的熒光信號明顯增強。熒光強度的強弱可以直接反應(yīng)抗體內(nèi)吞的效率。通過測量熒光信號強度，研究人員可以評估抗體內(nèi)吞效率。兩款產(chǎn)品的主要區(qū)別在于特異性標記的IgG亞型，如下表所示：

	AME100001	AME100002
specific IgG types	Human IgG1, IgG2, and IgG4 Rabbit IgG Mouse IgG2a and IgG2b	Human IgG1, IgG2, IgG3, and IgG4 Rabbit IgG Mouse IgG1, IgG2a, IgG2b, and IgG3

·DiTagTM pH sensitive IgG labeling reagent (AME100001)

Figure 3. The fluorescent signal from GPRC5D ADC BMK-AME100001 conjugate is only detected in GPRC5D positive cells (K562-GPRC5D stable expression cell line), indicating specific internalization.

Figure 4. Stability test of AME100001. Three storage methods are tested: lyophilization and reconstitution (black), liquid with 50% glycerol at -20℃ (red), liquid at 4℃ (blue). All three methods exhibit excellent stability.

·DiTagTM pH sensitive IgG labeling reagent plus (AME100002)

Figure 5. The fluorescent signal from GPRC5D ADC BMK-AME100002 conjugate is only detected in GPRC5D positive cells (K562-GPRC5D stable expression cell line), indicating specific internalization.

參考文獻：

[1] Hammood M, Craig AW, Leyton JV. Impact of Endocytosis Mechanisms for the Receptors Targeted by the Currently Approved Antibody-Drug Conjugates (ADCs)-A Necessity for Future ADC Research and Development. Pharmaceuticals (Basel). 2021 Jul 15;14(7):674.